产品简介
本试剂盒基于BCA法测定蛋白浓度，但使用了一种全新的螯合剂，室温孵育5min以内即可检测。在碱性环境中，蛋自质会与Cu2+络合，并将Cu2+还原成Cu+。蛋白将Cu2+还原成Cu+的还原力来源于两个方面，其一是肽键，其二是色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等还原性氨基酸的侧链基团。随后两个螯合剂分子与一个Cu+螯合，形成稳定的橙黄色复合物，其在480nm波长下有最高的光吸收值，并且该值在一定范围内与蛋白质浓度线性相关，通过带入吸光值换算，可以得出样品中蛋白的浓度。
本试剂盒在标准BCA方法的基础上进行了加快反应速度的优化，能在更短的时间内完成反应，提高蛋白测定的时间效率，适合与机器自动化检测。测定蛋白浓度的范围是0.05-5mg/mL，提供的标样可在0.05-2mg/mL 范围内线性拟合。在测定时，应保证样品中EDTA浓度≤5 mM，Tween20≤0.5%，无DTT，无EGTA。
使用方法（酶标板法）
1. 配置工作液
工作液现配现用。根据测量的样品加标样的总孔数计算需要的液体量。每个浓度的标样和待测样品建议测量3次。由于事先未知样品液的浓度，不知道其是否落在检测区间，如果条件允许，可以梯度稀释样品，分别检测。一般考虑到损耗，应多配几个孔，计算方法为：工作液体积总量=需要的孔数x200uL。
可以近似认为工作液体积等于试剂A的体积。在离心管中按照试剂A和试剂B为50:1的体积比配置显色工作液，充分混匀后待用。
2. 标准品稀释
本试剂盒提供牛血清白蛋白20mg/ml标准品1ml/支。测定前可以用纯化水或者PBS将标准品按照2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、Omg/ml序列稀释成标准蛋白浓度，形成蛋白浓度标准曲线。
3. 加液
各孔分别加入10L标样液或待检测的样品液，设置重复。每孔加入200uL显色工作液，室温下放置5min。加样时要轻柔，避免出现气泡。如果样品较多，建议使用排枪添加工作液。
4. 检测定量
设置酶标仪的检测波长为480nm，检测每孔的吸光度。
经过空白对照矫正后，即各标准样本吸光度平均值和待测样品吸光度平均值减去空白标准样品吸光度平均值，以标准样品浓度为横坐标，矫正后的吸光度的平均值为纵坐标，绘制散点图并拟合线性标准曲线，计算R2。如果重复中有过度离群点也应当剔除。一般R2>0.99为宜。带入样品的吸光度平均值，计算出样品中蛋白的浓度。
注意事项
1. 利用本试剂盒测量RIPA裂解液（强）和RIPA裂解液（弱）提取的蛋白浓度时，几乎不受干扰。
2. 在更宽的浓度范围内，蛋白浓度和吸光度并不呈现线性关系。此时可以使用曲线或者多项式拟合，或者低浓度范围和高浓度范围分别使用不同的直线方程拟合。
3. 试剂A和试剂B混合，配置工作液时，会有灰蓝色不溶物出现，充分混匀后沉淀消失，配好的工作液呈现绿色。建议工作液现配现用，配置好后在4°C可以稳定保存24h。
4. 本检测方法不是终点法，所以孵育时间和温度都会对吸光值产生影响。在测定低浓度样品时，可以相应延长显色的时间和反应的温度。但需要注意，改变孵育时间和温度会影响线性范围，例如高浓度的样品会出现吸光值饱和，最佳范围的确立可以通过标曲R2和回代偏差判断。
5. 由于颜色反应速度较快，假如不能立即读数，可以加入50L1MHCI终止反应。
6. 如果使用分光光度计测量吸光度，可以成倍扩大反应体系。建议操作检测时间不要超过10min，避免其它测量的反应液颜色过度加深。
