产品简介
BCA法是常用的蛋白浓度定量分析方法之一。其原理是，在碱性环境中，蛋白质会与Cu2+络合，并将Cu2+还原成Cu+。蛋白将Cu2+还原成Cu+的还原力来源于两个方面，其一是肽键，其二是色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等还原性氨基酸的侧链基团。随后两个BCA分子与一个Cu+螯合，形成稳定的蓝紫色复合物，其在562nm波长下有最高的光吸收值，并且该值在一定范围内与蛋白质浓度呈现很好的线性关系，通过带入吸光值换算，可以得出样品中蛋白的浓度。
在标准BCA试剂盒(200052)的基础上，使用了特殊的试剂C消耗蛋白溶剂中残留的还原性硫醇类物质，如DTT和β-巯基乙醇，试剂本身和反应后生成的新物质都不会参与显色反应，也就不会影响吸光度值。该测定方法在BCA法兼容高浓度去垢剂的优势下，提高了BCA法对还原剂的兼容能力。在测定时，对样品液中5%以内的去垢剂如SDS、Triton X-100、Tween 20、Tween 80、NP 40有很好的耐受力，兼容的还原剂DTT浓度提高至5mM、β-巯基乙醇浓度提高至10mM，但仍易受螯合剂的干扰，应保证EDTA浓度<10mM、EGTA浓度<1mM。在标准实验方案下，本试剂盒测定蛋白的最佳线性范围是50-2000µg/mL。
使用说明
1. 配制标准品工作液
吸取30μL蛋白标准品，用和待测蛋白样品一致的溶剂，例如裂解液，稀释至300μL，配置成2mg/mL的标准样品液。也可以使用0.9%NaCl、PBS或者纯水进行稀释。
2. 配制试剂C工作液
试剂C工作液现配现用，2 - 8℃避光存放24h，使用无影响。每样品孔需要使用的试剂C质量为0.2mg，试剂D体积为10μL。根据上一步确定的所需孔数，称取相应质量的试剂C溶解于相应体积的试剂D中，充分溶解后待用。
3. 试剂C处理样品
按照下表在酶标板中配制空白、标准曲线样品及待测样品，设置重复，37℃孵育15min。
| 组分名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 2 mg/mL 标准品(μL） | 0 | 0.5 | 1 | 2.5 | 5 | 7.5 | 10 |
| 补加稀释液(μL） | 10 | 9.5 | 9 | 7.5 | 5 | 2.5 | 0 |
| 试剂C工作液(μL） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 标样浓度(mg/mL) | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 |
4. 配制BCA 工作液
BCA 工作液现配现用 。根据测量的样品加标样的总孔数计算需要的液体量。每个浓度的标样和待测样品建议测量2-3次。一般考虑到损耗，应多配几个孔的量，计算方法为：工作液体积总量＝需要的孔数×200μL，可以近似认为工作液体积等于试剂A的体积。在离心管中按照试剂A和试剂B为50:1的体积比配置显色工作液，充分混匀后待用。
5. 定量检测
每孔加入200μL 显色工作液，37℃放置30min。加样时要轻柔，避免出现气泡。在562nm波长下检测每孔的吸光度。经过空白矫正后，以标准样品浓度为横坐标，矫正后的吸光度的平均值为纵坐标，绘制散点图并拟合线性标准曲线，计算R2，如果重复中有过度离群点应当剔除 。应使R2>0.99 。代入样品的吸光度平均值 ，计算出样品中蛋白的浓度。
注意事项
1. 可以调整样品液、试剂C工作液和显色工作液的混合比例，比如设定为1:1:10，降低可检测的浓度下限，但同时也增加了样品液中干扰物的影响。
2. 试剂A和试剂B混合配置显色工作液时，会有绿色絮状物出现，充分混匀后消失，属于正常现象。配置好的显色工作液呈现苹果绿。
3. 在更宽的浓度范围内，蛋白浓度和吸光度并不呈现线性关系。此时可以使用多项式拟合，或者低浓度范围和高浓度范围分别使用不同的直线方程拟合。最佳范围的确立可以通过标曲R2和回代后标样浓度的偏差判断。
4. 显色时间和温度都会对吸光值产生影响。在蛋白样品浓度过低时，可以相应延长显色的时间和反应的温度，但也要注意避免高蛋白浓度的样品显色进入平台期。
5. 试剂C处理时，勿通过加热加快反应速度，勿添加过量。
6. 如果使用分光光度计测量吸光度，可以成倍扩大反应体系。建议标样和样品的整体检测操作时间不要超过10 min，避免后测量的反应液颜色过度加深，造成检测结果过度偏差。
7. 本试剂盒检测方法在原理上存在不可避免的劣势。因为检测结果反应的是肽键和四种氨基酸（半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）的数目，而在多种蛋白混合且比例不同的样品中，吸光度并不能和蛋白实际浓度呈现完美的线性关系。为了提高检测的精度，可以使用相应的蛋白替换BSA。但是相较于Bradford法，相同浓度的不同蛋白间吸光度变异不算太大。
