产品描述
类器官活细胞荧光活力分析试剂盒提供了一种荧光检测方法，用于分析多孔板中的细胞和类器官活力。该检测无需细胞裂解：荧光染料可渗透活细胞，并与细胞内的代谢还原酶相互作用，产生荧光信号。为确保检测过程中活力评估的准确性，类器官活力检测试剂盒包含活细胞荧光染料和专用于类器官活力分析的特殊缓冲液。在配制好检测溶液后，将其加入细胞/类器官培养体系中以测量荧光信号。本检测通过测量代谢活性来评估细胞活力：活细胞可将试剂盒中的荧光染料还原为红色荧光产物（激发波长：560 nm；发射波长：590 nm），而无活力的细胞会迅速丧失代谢活性，因此无法还原染料，从而不产生荧光信号。信号强度与系统中活细胞的数量成正比。实现对类器官活力的直接快速评估。
产品特点
类器官活细胞荧光活力分析试剂盒具备以下核心优势：
(1) 无需消化与裂解；
(2) 高灵敏度线性响应：检测方法具备高灵敏度线性响应特性，最低检测时间仅需30min，可实现每孔至少100个细胞的活性评估；
(3) 加样便捷：检测前后无需清洗步骤；
(4) 无毒非灭菌荧光染料：所用荧光染料无毒无害，不影响细胞正常代谢或基因表达；
(5) 荧光检测原理：基于荧光检测原理，无需使用黑色或不透明白底细胞培养板；
(6) 类器官专用活性检测缓冲液；
(7) 校准与误差校正：支持多次检测以校准并修正实验过程中因人工操作培养板导致的数据偏差。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
单通道或多通道移液器、3D微组织培养多孔板、荧光酶标仪
二、检测试剂制备
1. 制备1×类器官活力检测工作液：
将组分A（活细胞荧光染料，10×）用组分B（类器官活力检测缓冲液）稀释，配制1×类器官活力检测工作液。配制10 mL工作液时，将9 mL组分B与1 mL组分A混合。充分混匀，并在120min内使用。
注：首次使用时，建议按单次使用量的3-5倍进行分装。组分A含有荧光染料，分装后需避光保存。
2. 使用前，请轻轻颠倒溶液数次，以混匀检测工作液。
3. 对于二维细胞活力检测：将活细胞荧光染料（组分A）用完全细胞培养基稀释。建议使用96孔板进行检测。若使用其他类型孔板，请参照下表确定所需工作液体积及组分用量。
三、类器官持续活力评估
1. 从培养箱中取出96孔细胞培养板。尽可能彻底弃去孔中现有完全培养基，避免：
(a) 染料被进一步稀释；
(b) 类器官培养残留物影响染料；
(c) 完全类器官培养基中的成分产生干扰。
2. 沿各孔侧壁缓慢加入100uL 1X类器官活力检测工作液。设置无类器官孔作为染料阴性对照。将培养板置于培养箱中孵育30-120min。当含细胞或类器官孔内工作液由蓝色变为粉红色时，即可进行下一步操作。
注：若细胞数量较少，工作液在孵育30至120min后可能仍保持蓝色，这不会影响检测结果。
3. 荧光测量：使用荧光酶标仪（激发/发射波长：560(±10)Ex/590(±10)Em）测量并记录总荧光强度。
注：±10表示在激发波长560nm/发射波长590nm附近的±10nm检测范围。
4. 测量完成后，弃去96孔板中的液体，更换为新鲜完全培养基。继续培养2d。
5. 重复步骤1、2和3。通常情况下，在健康生长条件下，类器官细胞的活力会随着培养时间的延长而增强。例如，总荧光值应每2d增加20%以上。
6. 数据分析：根据总荧光强度（扣除染料阴性对照）分析类器官的相对活力。
四、类器官药物敏感性检测
1. 将类器官消化为单细胞进行传代。例如，在96孔板中每孔接种3000个细胞，使用3-5uL基质胶，培养2d使单细胞重新形成类器官。在药物处理前，可使用活力检测试剂盒检测各孔类器官的活力以校准铺板误差（可选）：
a. 从培养箱中取出96孔板，弃去孔中原有的完全培养基；
b. 沿孔壁缓慢向每孔加入100uL 1×类器官活力检测工作液。设置无类器官的孔作为染料阴性对照。将培养板置于培养箱中孵育30-120min。若含细胞/类器官的工作液颜色由蓝转红（注：细胞量较少时，孵育30-120分钟后工作液可能仍呈蓝色，不影响检测结果），即可进行后续步骤;
c. 使用荧光酶标仪（激发/发射波长：560(±10) nm/590(±10) nm）测量总荧光强度，并记录该数值。
2. 弃去96孔板中的液体，加入不同浓度药物（使用类器官完全培养基配制药液，包括药物阴性对照组，每组设置三个或以上复孔）。继续孵育。药物处理3-5d后，类器官活力检测试剂盒评估类器官活性。
3. 按照步骤1中的a)、b)和c)项相同流程操作，确保给药前后的孵育时间保持一致。
4. 根据总荧光强度（扣除染料和药物阴性对照值）分析类器官的相对活力
5. 在药物敏感性试验中，为校正接种误差而采用的类器官相对活力计算公式如下：
n(n≥ 3)：药物敏感性实验中的重复次数；A1：给药前测量值；A2：给药后测量值；Ox：不同药物浓度处理组；NC：染料阴性对照组；VC：药物阴性对照组；\overline{NCA2}：给药后染料阴性对照组的平均值；\overline{NCA1}：染料阴性对照组的平均值。
6. 若仅在药物处理后使用类器官活力检测试剂盒，则类器官活力计算公式为：
Ox：不同药物浓度处理组；NC：染料阴性对照组；VC：药物阴性对照组；$\overline{N C}$：染料阴性对照组的平均值；$\overline{V C}$：药物阴性对照组的平均值。
注意事项
1. 适当的细胞密度可提高检测灵敏度。针对96孔板，建议每孔接种细胞数超过100个且少于10万个。
2. 整个检测过程应避免阳光直射（实验室白光影响甚微），并在无菌条件下进行，因为微生物污染会影响检测结果。
3. 加入检测试剂后的孵育时间取决于细胞浓度。对于低细胞浓度，应延长孵育时间；而对于高细胞浓度，则应缩短孵育时间。建议使用荧光酶标仪从板底进行检测，因为板盖上的冷凝水以及孔上方标记笔的痕迹会显著影响读数。
4. 计算活力值时，需减去阴性对照（无细胞/类器官的孔）的数值。对于药物敏感性检测，则应减去药物对照的数值。
