产品描述
人肝细胞类器官分化试剂盒是一种化学成分明确、无血清的培养体系，专为驱动成体肝细胞来源类器官的功能成熟而设计。本试剂盒需与人肝细胞类器官扩增试剂盒配套使用。该体系能有效模拟体内肝小叶复杂的代谢异质性，通过诱导显著的空间分区效应，促进关键代谢标志物的差异化表达—特异性定位中央静脉样区域（CYP2E1+）和门静脉周围样区域（GLUT1+）。这一高保真模型可生成具有卓越代谢活性的成熟类器官，为药物代谢研究、肝脏疾病建模及高端转化研究提供高度可重复、标准化的研究工具。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始实验流程前，请确保所有组分与设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C&D，解冻后震荡混匀。配方I驱动肝细胞类器官向门静脉样表型发展，其特征为表达HAL和ASS1等门静脉标志物。配方II添加了组分D，可激活Wnt信号通路并促进中央静脉样表型形成，同时强效表达CYP2E1和GLUL。研究人员可根据需要研究门静脉周围或中央静脉周围肝功能，选择相应的配方。
配方Ⅰ（门静脉表型）：取9.76mL人肝细胞类器官分化基础培养基+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*），充分混匀。
配方Ⅱ（中央静脉表型）：取9.72mL人肝细胞类器官分化基础培养基+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*）+0.04mL补充剂D（250*），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素， 完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 完全培养基37℃室温平衡。
二、人肝细胞类器官分化方案
涉及人类原代组织材料的研究必须遵守所有相关的机构和政府法规。在收集人类原代组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。
1. 进行分化前，必须先使用人肝细胞扩增培养基扩增1.5-2周，然后更换为分化培养基。以下部分概述了启动分化前的预扩增流程。
2. 在室温下，以300g的转速离心3分钟。
3. 小心弃上清，可残留部分基质胶，加入0.2mL类器官消化液重悬类器官，吹打混匀后置于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中分离。类器官一般3min可完成消化，期间可吹打混匀。
注：切勿在类器官消化液中解离超过5min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准为：当观察到细胞团块（由10-50个细胞组成）时，表明消化步骤已完成。
4. 消化完成后加入1mL上皮类器官基础培养基清洗一次，在室温下，以300g的转速离心3min。
5. 吸去上清液，将类器官沉淀重悬于基质胶中，并以液滴形式铺于培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的加湿培养箱中孵育15-25min。
6. 待基质胶液滴凝固后（15-25min），沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官扩增培养基。
7. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，每3天更换一次扩增基，类器官培养1.5-2周用于后续实验。
8. 更换为人肝细胞类器官分化培养基，培养1.5-2周。在此期间，每3天更换一次分化培养基。
9. 此阶段结束时，分化过程即告完成。分化后的肝细胞类器官（dHHOs）应表现出成熟的肝脏特征，包括CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1的表达，以及胆小管形成和肝细胞极性等功能指标。
图1. 图像展示了人肝细胞类器官在分化培养基中第15天至第29天的形态（比例尺：100μm）。图中显示了eHHOs与dHHOs中ALB、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1及ABCB11的mRNA表达水平。细胞色素P450 CYP3A4酶活性通过化学发光法在第0、5、10、15、20天进行检测。肝细胞类器官的白蛋白分泌量通过ELISA法在第0、7、10、14天进行定量分析。尿素分泌量则采用比色法在第0、5、10、15、20天进行评估。（eHHO：扩增期肝细胞类器官；dHHO：分化期肝细胞类器官）
