产品描述
人肝细胞类器官扩增试剂盒是一种化学成分明确、无血清的培养基，专为成人肝脏来源的肝细胞类器官的快速高效增殖而配制。该系统能够实现稳健、长期的扩增，同时忠实保留原代肝细胞的核心生理特性，包括白蛋白和HNF4a等经典标志物的持续表达。通过提供稳定且可重复的环境，该试剂盒有助于生成适用于高通量药物筛选、疾病建模和再生医学研究的大规模类器官培养物。作为一个可靠的体外平台，它是在精确控制的无血清工作流程中研究肝脏发育和肝胆病理生理学的重要基础。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始实验流程前，请确保所有组分与设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C，解冻后震荡混匀。
例：取9.76mL人肝细胞类器官扩增培养基+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素，完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 类器官培养基质胶ECM置于4℃解冻。
5. 完全培养基室温平衡。
二、人肝细胞类器官构建方案
1. 获取原代人肝细胞，可通过商业渠道购买，或使用新鲜分离的并分选的原代肝细胞，收到或分选后，将原代人肝细胞置于冰上并立即进行培养。
2. 吸去上清液，将细胞沉淀重悬于类器官培养基质胶中。类器官培养基质胶应置于冰上以防止凝固。类器官培养基质胶的使用量取决于细胞沉淀的大小。约 3000 个细胞应接种于25uL类器官培养基质胶中。
注：切勿过度稀释类器官培养基质胶（ECM体积占比需＞70%），否则可能阻碍固态液滴的正常形成。
3. 在24孔细胞培养板的底部，将含有细胞的类器官培养基质胶以约25uL的液滴形式接种于孔板中心周围。
注：一旦将细胞重悬于基质胶中，请尽快操作，因为基质胶可能在管中或移液器吸头内固化。切勿让细胞外基质接触孔壁。
4. 待基质胶液滴凝固后（15-25min），沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
5. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，每3d更换培养基。
6. 密切监测类器官形成情况。理想情况下，患者来源人肝细胞类器官应在初始接种后7天形成，约3周进行首次传代。
三、类器官传代
1. 用移液器吸取1mL上皮类器官基础培养基，吹打破坏基质胶，并将类器官悬浮液转移至1.5mL离心管中。继续上下吹打20次以上以产生压力，帮助去除基质胶。
2. 在室温下，以300g的转速离心3min。
3. 小心弃上清，可残留部分基质胶，加入0.2mL类器官消化液重悬类器官，吹打混匀后置于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中分离。类器官一般3min可完成消化，期间可吹打混匀。
注：切勿在类器官消化液中解离超过5min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准为：当观察到细胞团块（由10-50个细胞组成）时，表明消化步骤已完成。
4. 消化完成后加入1mL上皮类器官基础培养基清洗一次，在室温下，以300g的转速离心3min。
5. 吸去上清液，将类器官沉淀重悬于基质胶中，并以液滴形式铺于培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的加湿培养箱中孵育15-25min。
6. 待基质胶液滴凝固后（15-25min），沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
7. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，直至需要将类器官用于后续实验。
8. 传代过程中可能观察到出现的空泡状肝内胆管类器官。可通过克隆挑取的方式选择性去除，维持纯净的肝细胞类器官。
图1. 图像展示了在第3、7、10和13天于人类肝细胞扩增培养基中培养的肝细胞类器官。肝细胞类器官经HNF4a（红色）和MRP2（绿色）免疫染色显示。
