产品描述
人气管（分化）类器官试剂盒是一种无血清培养基，专用于源自人气管干细胞的人气管类器官（hAOs）的分化培养。在分化条件下培养10-14天后，气管类器官会形成清晰的管腔结构，在显微镜下可观察到其内部广泛的纤毛摆动或分泌物质积累。分化后的hAOs展现出成熟气管上皮的关键功能与结构特征，包括运动纤毛中微管蛋白的高表达以及黏液分泌杯状细胞中MUC5AC的高表达。结合人气管（扩增）类器官试剂盒使用，该分化系统能够在体外稳定、可重复地生成气管上皮，为呼吸系统研究、毒理学、药物发现和再生医学领域的广泛应用提供支持。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始实验流程前，请确保所有组分与设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C，解冻后震荡混匀。
例：取9.776mL人脑（分化）类器官基础培养基+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素， 完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 完全培养基室温平衡。
二、人气管（分化）类器官分化方案
1. 上下吹打以破坏ECM，并将类器官悬浮液转移至1.5 mL离心管中。继续上下吹打以产生压力，帮助去除ECM。
2. 室温下以300g离心3min。
3. 吸去上清液，使用类器官消化液或通过机械破碎法分割类器官。
基于类器官消化液的细胞消化：将沉淀重悬于0.2 mL类器官消化液中，反复吹打并于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中释放。每2min用带滤芯的吸头反复吹打≥8次以促进类器官消化。密切监测消化过程，使类器官消化液中的孵育时间保持在最短。
基于机械破坏的细胞消化：将细胞沉淀重悬于1 mL上皮类器官基础培养基中。小心地将类器官悬液沿管底反复吹吸30次以产生压力，这将有助于类器官的破碎。
注：切勿在类器官消化液中消化超过7min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准是：当观察到细胞形成由10-50个细胞组成的小团块混合物时，表明消化步骤已完成。
4. 剪切完成后，加入1 mL上皮类器官基础培养基清洗一次，于室温下以300g离心3min。
5. 吸弃上清液，将类器官沉淀重悬于ECM中，以液滴形式铺于24孔培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的湿润培养箱中静置15min。
6. 待ECM液滴凝固后，小心地将人气管（扩增）类器官基础培养基移入孔板中。
7. 将培养板置于37℃、CO₂的湿润培养箱中，培养3d。
8. 更换为人气管（分化）类器官基础培养基，培养10-14d。在此期间，每3d更换一次培养基。
注：若在扩增阶段类器官密度较低，当类器官直径达到150uM或更大时，可直接应用分化培养基。若密度较高，可在更换分化培养基前将类器官稀释并重铺培养。
9. 经过10-14d的分化培养后，可观察到气管类器官管腔内出现明显的纤毛摆动或分泌物积聚。此时可终止分化并采集样本。
