产品描述
小鼠肝胆管（分化）类器官试剂盒是一种用于培养源自成体干细胞的小鼠肝胆管(mLDs)类器官的无血清培养基。本试剂盒需与小鼠肝胆管（扩增）类器官试剂盒（无血清）配套使用。在扩增培养基中培养时，小鼠肝胆管类器官扩增培养基中的mLDs类器官主要由胆管细胞组成，其特征是表达Sox9和Ck19等标志物。当扩增培养基更换为分化培养基时，mLDs类器官可分化成肝细胞，这些细胞表现出包括白蛋白、Cyp3a11和Mup20在内的肝细胞特异性标志物。小鼠肝胆管类器官在组织结构、细胞类型组成和自我更新动态方面展现出导管上皮的典型特征，因此在小鼠肝脏发育和疾病研究领域具有巨大潜力。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始实验流程前，请确保所有组分与设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C&D，解冻后震荡混匀。
配方Ⅰ：取9.76mL小鼠肝胆管类器官分化基础培养基+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*），充分混匀。
配方Ⅱ：取9.75mL小鼠肝胆管类器官分化基础培养基+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*）+0.01mL补充剂D（1000*），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素， 完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 完全培养基37℃室温平衡。
二、小鼠肝胆管类器官传代方案
1. 使用移液器上下吹打以破坏ECM，并将类器官悬浮液转移至1.5 mL离心管中。继续上下吹打以产生压力，帮助去除ECM。室温300g离心3min。
2. 吸去上清液，使用类器官消化液或通过机械破碎法分割类器官。
基于类器官消化液的细胞消化：将沉淀重悬于0.2 mL类器官消化液中，反复吹打并于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中释放。每2min用带滤芯的吸头反复吹打≥8次以促进类器官消化。密切监测消化过程，使类器官消化液中的孵育时间保持在最短。
基于机械破坏的细胞消化：将细胞沉淀重悬于1 mL上皮类器官基础培养基中。小心地将类器官悬液沿管底反复吹吸30次以产生压力，这将有助于类器官的破碎。
注：切勿在类器官消化液中消化超过7min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准是：当观察到细胞形成由10-50个细胞组成的小团块混合物时，表明消化步骤已完成。
3. 消化完成后，加入1 mL上皮类器官基础培养基清洗一次，在室温下以300g离心3min。
4. 吸弃上清液，将类器官沉淀重悬于ECM中，并以液滴形式铺于培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的湿润培养箱中静置15min。
5. 待ECM液滴凝固后，取0.5mL小鼠肝胆管类器官扩增培养基沿着孔板边缘加到孔板中。
6. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，直至需要将类器官用于后续实验。
三、鼠肝胆管类器官分化方案
1. 当小鼠肝管类器官生长至100-150uM时，将培养液更换为小鼠肝管类器官分化培养基I，持续培养9d。
2. 更换为小鼠肝管类器官分化培养基II，培养3d。
注：在此期间，每3d更换一次培养基。若肝细胞特异性标志物表达不足，可延长在培养基II中的培养时间。
