产品描述
人食管类器官试剂盒是一种用于培养源自成体干细胞的人食管类器官的无血清培养基。这些食管类器官展现出类似天然食管组织的复杂结构，其细胞组成包含基底细胞（TP63+, KRT5+, KRT14+）和分化的鳞状细胞（KRT3+）。人食管类器官在组织结构、细胞类型组成和自我更新动态方面均表现出食管的关键特征，因此为研究食管发育、疾病机制和药物反应提供了有价值的模型。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始实验流程前，请确保所有组分与设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C，解冻后震荡混匀。
例：取9.76mL类器官基础培养基A+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素，完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 类器官培养基质胶ECM置于4℃解冻。
5. 完全培养基室温平衡。
二、类器官构建方案
1. 使用锥形管在组织保存液中收集组织活检样本。将组织活检样本保持在4℃直至开始分离操作。
2. 使用DPBS（加双抗）冲洗组织，直至上清液澄清。
3. 在1.5mL离心管中将组织剪成1-3mm3移至15mL离心管中。
4. 在15 mL锥形管中加入10 mL组织消化液，于37℃条件下消化组织碎片，孵育时间根据情况可在5-30min范围内调整。密切监控消化过程，每5-10min剧烈摇晃试管或使用移液器反复吹打混合物以混匀内容物。注：为避免过度消化，当显微镜下出现大量细胞团时应立即停止消化。
5. 向组织消化混合物中添加FBS至终浓度为2%来终止组织消化，并使用100uM细胞筛网过滤。
6. 在4℃条件下300g离心5min。小心吸弃上清液，保留管底的沉淀。若观察到红色沉淀，则吸弃上清液，使用1 mL红细胞裂解液重悬沉淀，于室温裂解红细胞3min，300g离心5min。
7. 吸弃上清液，将沉淀重悬于上皮类器官基础培养基中，300g离心3min，弃上清，重复一次。
8. 吸弃上清液，用ECM重悬细胞沉淀。ECM需置于冰上以防凝固，操作需迅速。ECM用量取决于细胞沉淀大小，约10,000个细胞应接种于25uL ECM中。
注：切勿过度稀释类器官培养基质胶（ECM体积占比需＞70%），否则可能阻碍固态液滴的正常形成。
9. 在24孔细胞培养板的底部，将含有细胞的类器官培养基质胶以约25uL的液滴形式接种于孔板中心周围。
注：一旦将细胞重悬于基质胶中，请尽快操作，因为基质胶可能在管中或移液器吸头内固化。切勿让细胞外基质接触孔壁。
10. 待基质胶液滴凝固后（15-25min），沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
11. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，每3d更换培养基理想情况下，类器官应在初始接种后5至8天内进行首次传代。
三、类器官传代
1. 弃上清，用移液器吸取1mL上皮类器官基础培养基，吹打破坏基质胶，并将类器官悬浮液转移至1.5mL离心管中。继续上下吹打20次以上以产生压力，帮助去除基质胶。
2. 在室温下，300g离心3min。
3. 吸去上清液，使用类器官消化液或通过机械破碎法分割类器官。
基于类器官消化液的细胞消化：将沉淀重悬于0.2 mL类器官消化液中，反复吹打并于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中释放。每2min用带滤芯的吸头反复吹打≥8次以促进类器官消化。密切监测消化过程，使类器官消化液中的孵育时间保持在最短。
基于机械破坏的细胞消化：将细胞沉淀重悬于1 mL上皮类器官基础培养基中。小心地将类器官悬液沿管底反复吹吸30次以产生压力，这将有助于类器官的破碎。
注：切勿在类器官消化液中消化超过7min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准是：当观察到细胞形成由10-50个细胞组成的小团块混合物时，表明消化步骤已完成。
4. 剪切完成后，加入1 mL上皮类器官基础培养基清洗一次，300g离心3min。
5. 吸去上清液，将类器官沉淀重悬于基质胶中，并以液滴形式铺于培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的加湿培养箱中孵育15min。
6. 待基质胶液滴凝固后，沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
7. 将培养板置于37℃5%CO₂的加湿培养箱中，直至需要类器官进行后续实验。
