产品描述
小鼠肝胆管（扩增）类器官试剂盒是一种用于成年干细胞来源的小鼠肝胆管类器官（mLDs）的无血清培养基。肝胆管上皮的自我更新由干细胞及其祖细胞的增殖所驱动。在小鼠肝胆管类器官扩增培养基中，mLDs 主要由表达 SOX9 和 CK19 的胆管细胞组成。mLDs 在组织结构、细胞类型组成和自我更新动态方面展现出胆管上皮的典型特征，因此在研究肝胆管发育和疾病方面具有巨大潜力。通过体外扩增肝胆管上皮，小鼠肝胆类器官在再生生物学领域也可能具有应用前景。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始实验流程前，请确保所有组分与设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C，解冻后震荡混匀。
例：取9.76mL类器官基础培养基A+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素，完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 类器官培养基质胶ECM置于4℃解冻。
5. 完全培养基室温平衡。
二、类器官构建方案
1. 使用锥形管在组织保存液中收集组织活检样本。将组织活检样本保持在4℃直至开始分离操作。
2. 使用DPBS（加双抗）冲洗组织，直至上清液澄清。
3. 在1.5mL离心管中将组织剪成1-3mm3移至15mL离心管中。
4. 在15 mL锥形管中加入10 mL组织消化液，于37℃条件下消化组织碎片，孵育时间根据情况可在30-60min范围内调整。密切监控消化过程，每5-10min剧烈摇晃试管或使用移液器反复吹打混合物以混匀内容物。注：为避免过度消化，当显微镜下出现大量细胞团时应立即停止消化。
5. 向组织消化混合物中添加FBS至终浓度为2%来终止组织消化，并使用100uM细胞筛网过滤。
6. 在4℃条件下300g离心5min。小心吸弃上清液，保留管底的沉淀。若观察到红色沉淀，则吸弃上清液，使用1 mL红细胞裂解液重悬沉淀，于室温裂解红细胞3min，300g离心5min。
7. 吸弃上清液，将沉淀重悬于上皮类器官基础培养基中，300g离心3min，弃上清，重复一次。
8. 吸弃上清液，用ECM重悬细胞沉淀。ECM需置于冰上以防凝固，操作需迅速。ECM用量取决于细胞沉淀大小，约10,000个细胞应接种于25uL ECM中。
注：切勿过度稀释类器官培养基质胶（ECM体积占比需＞70%），否则可能阻碍固态液滴的正常形成。
9. 在24孔细胞培养板的底部，将含有细胞的类器官培养基质胶以约25uL的液滴形式接种于孔板中心周围。
注：一旦将细胞重悬于基质胶中，请尽快操作，因为基质胶可能在管中或移液器吸头内固化。切勿让细胞外基质接触孔壁。
10. 待基质胶液滴凝固后（15-25min），沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
11. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，每3d更换培养基理想情况下，类器官应在初始接种后7-10d首次传代。
三、类器官传代
1. 弃上清，用移液器吸取1mL上皮类器官基础培养基，吹打破坏基质胶，并将类器官悬浮液转移至1.5mL离心管中。继续上下吹打20次以上以产生压力，帮助去除基质胶。
2. 在室温下，300g离心3min。
3. 吸去上清液，使用类器官消化液或通过机械破碎法分割类器官。
基于类器官消化液的细胞消化：将沉淀重悬于0.2 mL类器官消化液中，反复吹打并于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中释放。每2min用带滤芯的吸头反复吹打≥8次以促进类器官消化。密切监测消化过程，使类器官消化液中的孵育时间保持在最短。
基于机械破坏的细胞消化：将细胞沉淀重悬于1 mL上皮类器官基础培养基中。小心地将类器官悬液沿管底反复吹吸30次以产生压力，这将有助于类器官的破碎。
注：切勿在类器官消化液中消化超过7min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准是：当观察到细胞形成由10-50个细胞组成的小团块混合物时，表明消化步骤已完成。
4. 剪切完成后，加入1 mL上皮类器官基础培养基清洗一次，300g离心3min。
5. 吸去上清液，将类器官沉淀重悬于基质胶中，并以液滴形式铺于培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的加湿培养箱中孵育15min。
6. 待基质胶液滴凝固后，沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
7. 将培养板置于37℃、5%CO₂的加湿培养箱中，直至需要类器官进行后续实验。
图1. 小鼠肝胆管类器官在不同传代次数的图像。每张图片下方标注了传代次数以及传代后培养天数，比例尺：100uM
