产品描述
人卵巢癌类器官试剂盒是一种用于建立和维持人卵巢癌类器官的无血清细胞培养基。该试剂盒支持患者来源的肿瘤类器官生长，能够复现原始肿瘤的形态学、病理学、遗传学、表型学及行为特征。该无血清配方可最大程度减少变异，确保卵巢癌类器官培养的可靠性与可重复性。卵巢癌类器官试剂盒是推动医学研究与精准医疗的强大工具。
使用说明
注：本产品仅供研究使用。
一、实验前准备
在开始操作前，请确保所有组件和设备均已准备妥当：
1. 确认所有组分均按照手册提供的指南进行储存。对于敏感试剂，应避免反复冻融。
2. 确保所有设备，如培养箱、移液器和离心机，均经过校准且功能正常。
3. 完全培养基配置：冰上或4℃解冻补充剂B&C&D&E&F&G，解冻后震荡混匀。
鉴于卵巢癌存在多种分子亚型，完整培养基的配制也会根据其病理亚型涉及不同组分。
注：由于浆液性卵巢癌具有高度异质性，需测试不同配方，并选取生长效果最佳者用于后续培养。
根据以下列表，基于其亚型准备完全培养基：
| 癌种 | 配方1(ABCE） | 配方2(ABCDF） | 配方3(ABCDFG） |
| High-grade Serous Ovarian Carcinoma (HGSOC) | √ | √ | √ |
| Low-grade Serous Ovarian Carcinoma (LGSOC) | √ | √ | |
| Mucinous Ovarian Carcinoma (MOC) | √ | ||
| Ovarian Endometrioid Carcinoma (OEC) | √ | ||
| Ovarian Clear Cell Carcinoma (OCCC) | √ |
配方1：取9.72mL卵巢癌类器官基础培养基A+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*）+0.04mL补充剂E（250*），充分混匀。
配方2：取9.72mL卵巢癌类器官基础培养基A+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*）+0.04mL补充剂D（250*）+0.005mL补充剂F（2000*），充分混匀。
配方3：取9.70mL卵巢癌类器官基础培养基A+0.2mL补充剂B（50*）+0.04mL补充剂C（250*）+0.04mL补充剂D（250*）+0.005mL补充剂F（2000*）+0.02mL补充剂G（500x），充分混匀。
注：无需额外加入抗生素，完全培养基保存于4℃，且在2周内使用。
4. 类器官培养基质胶ECM置于4℃解冻。
5. 完全培养基室温平衡。
二、类器官构建方案
1. 将卵巢癌活检组织置于组织保存液中。将组织样本保持在4℃直至分离操作开始。
2. 评估所获得的活检组织是否完全由肿瘤组织构成。若存在脂肪或肌肉组织，需在解剖显微镜下使用手术剪或手术刀及镊子尽可能去除这些非肿瘤成分。否则，直接进入步骤3。
3. 使用肿瘤类器官基础培养基或DPBS（加双抗）清洗组织两次。
4. 在1.5mL离心管中使用手术剪将组织切成1-3 mm³的小块。
5. 转移至15mL离心管，用10mL肿瘤组织消化液于37℃消化组织片段，孵育时间可在5至30min范围内灵活调整。需密切监控消化过程，每5-10min通过剧烈震荡或上下吹打混合管内内容物。当大部分组织片段可通过1mL移液器吸头时，表明消化过程已完成，镜检存在大量小细胞团或单细胞可终止消化。
6. 通过向组织消化混合物中加入0.2mL胎牛血清，使其终浓度达到2%，以终止组织消化，并使用100uM细胞筛进行过滤。
7. 收集过滤后的细胞，在4℃条件下以300g离心3min。若观察到可见的红色沉淀，吸弃上清液，使用2mL红细胞裂解液重悬沉淀，在室温下裂解红细胞1min，随后在4℃条件下以300g离心3min。
8. 吸去上清液，用肿瘤类器官基础培养基重悬沉淀，4℃下300g离心3min。重复此步骤一次。
9. 吸去上清液，将细胞沉淀重悬于类器官培养基质胶中。类器官培养基质胶应置于冰上以防止凝固。类器官培养基质胶的使用量取决于细胞沉淀的大小。约 10,000 个细胞应接种于25uL类器官培养基质胶中。
注：切勿过度稀释类器官培养基质胶（ECM体积占比需＞70%），否则可能阻碍固态液滴的正常形成。
10. 在24孔细胞培养板的底部，将含有细胞的类器官培养基质胶以25uL的液滴形式接种于孔板中心周围。
注：一旦将细胞重悬于基质胶中，请尽快操作，因为基质胶可能在管中或移液器吸头内固化。切勿让细胞外基质接触孔壁。
11. 待基质胶液滴凝固后（15-25min），沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
12. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中，每3-4d更换培养基。
13. 密切监测类器官形成情况。理想情况下，患者来源卵巢癌类器官应在初始接种后5至8d进行首次传代
三、类器官传代
1. 用移液器吹打破坏基质胶，并将类器官悬浮液转移至1.5mL离心管中。继续上下吹打20次以上以产生压力，帮助去除基质胶。
2. 在室温下，以300g的转速离心3min。
3. 吸去上清液，使用类器官消化液或通过机械破碎法分割类器官。
基于类器官消化液的细胞消化：将沉淀重悬于0.2 mL类器官消化液中，反复吹打并于37℃孵育，直至类器官从细胞外基质中释放。每2min用带滤芯的吸头反复吹打≥8次以促进类器官消化。密切监测消化过程，使类器官消化液中的孵育时间保持在最短。
基于机械破坏的细胞消化：将细胞沉淀重悬于1 mL肿瘤类器官基础培养基中。小心地将类器官悬液沿管底反复吹吸30次以产生压力，这将有助于类器官的破碎。
注：切勿在类器官消化液中消化超过7min，否则可能导致类器官生长不良甚至培养失败。经验判断标准是：当观察到细胞形成由10-50个细胞组成的小团块混合物时，表明消化步骤已完成。
4. 消化完成后加入1mL肿瘤类器官基础培养基清洗一次，在室温下300g离心3min。
5. 吸去上清液，将类器官沉淀重悬于基质胶中，并以液滴形式铺于培养板底部。接种后，将培养板转移至37℃、5%CO2的加湿培养箱中孵育15-25min。
6. 待基质胶液滴凝固后，沿着孔侧壁向每个孔中小心加入0.5mL类器官完全培养基。
7. 将培养板置于37℃、5%CO2的加湿培养箱中。
